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重組菌株高通量涂布：聲波移液的創(chuàng)新解決方案
合成生物學(xué)是一門基于工程化原理設(shè)計(jì)、構(gòu)建和優(yōu)化生物系統(tǒng)的新興交叉學(xué)科。分子克隆是合成生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)，而平板涂布作為分子克隆中的核心步驟，對(duì)確保重組質(zhì)粒純度和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性至關(guān)重要，但傳統(tǒng)手工涂布（96樣本/96平板）需90分鐘，自動(dòng)化系統(tǒng)（如QPix 460）仍需30分鐘，通量不足且耗材量大，制約高通量應(yīng)用，亟需開(kāi)發(fā)高吞吐、低耗材的微型化涂布新技術(shù)。
Echo®移液系統(tǒng)采用動(dòng)態(tài)流體分析（Dynamic Fluid Analysis™，DFA）和聲學(xué)微滴噴射（Acoustic Droplet Ejection，ADE）的專利技術(shù)（U.S.Patent 6,938,995），該技術(shù)無(wú)需吸頭，使用非接觸式移液的方式完成nL級(jí)體積的菌液至固體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移，極大地提高涂布實(shí)驗(yàn)的效率，同時(shí)降低耗材和硬件成本。
nL級(jí)移液，減小反應(yīng)體系，節(jié)約樣品和試劑成本；
無(wú)需吸頭等耗材，更低的耗材成本；
無(wú)液體殘留，更高的移液準(zhǔn)確度，更低的移液CV值；
非接觸移液，消除交叉污染；
靈活移液，可從來(lái)源板任意孔移液至目的板任意孔；
快速移液，3分鐘內(nèi)完成25nL 384孔板的移液。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-從頭構(gòu)建質(zhì)粒與Echo高通量平
采用同源序列引物分別擴(kuò)增載體PL2214（9330bp）及目的片段C（1443bp）、D（1581bp）、E（1656bp），通過(guò)同源重組構(gòu)建重組質(zhì)粒。每組基因設(shè)兩個(gè)平行（C1/C2、D1/D2、E1/E2），以減少實(shí)驗(yàn)誤差，確保結(jié)果的可靠性。將C1/D1/E1菌液進(jìn)行梯度稀釋（原液、10×、20×、50×）；C2/D2/E2菌液濃縮10倍后稀釋（原液、10×、50×、100×），共制備24個(gè)稀釋樣本。使用Echo 525將稀釋菌液以25nL/液滴轉(zhuǎn)移至384孔PP板，每個(gè)樣本點(diǎn)樣48個(gè)單克隆至含Amp的LB 8格板。
界面友好，填空以及鼠標(biāo)點(diǎn)選的編寫方式；
自帶移液模板，支持多種溶液類型同時(shí)移液；
靈活移液，支持來(lái)源板任意孔到目的板任意孔的移液；
數(shù)據(jù)追蹤，自動(dòng)生成移液報(bào)告。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
本應(yīng)用方案成功建立了基于聲波轉(zhuǎn)移的高精度菌落陣列構(gòu)建方法：
針對(duì)3種質(zhì)粒構(gòu)建體系，分別設(shè)置8個(gè)梯度稀釋條件，通過(guò)Echo 525非接觸式轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將每個(gè)樣品以48個(gè)25nL液滴（共計(jì)1.2μL/樣品）精準(zhǔn)分配至SBS標(biāo)準(zhǔn)8格板。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：
原液直接涂布即可獲得有效單克隆；
10倍濃縮菌液產(chǎn)生的單克隆數(shù)量顯著高于未濃縮組。
圖2：使用Echo 525做平板涂布，平板上長(zhǎng)出的單菌落
菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果：
隨機(jī)挑選18個(gè)單菌落做菌落PCR，17個(gè)擴(kuò)增出特異性目的條帶（陽(yáng)性率94.4%），1個(gè)無(wú)擴(kuò)增，所有產(chǎn)物送測(cè)序驗(yàn)證。
圖3：菌落PCR電泳結(jié)果
測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果：
17個(gè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析，均顯示純凈單峰，序列與預(yù)期完全匹配，證實(shí)17個(gè)菌落均為目標(biāo)單克隆，測(cè)序結(jié)果與菌落PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
圖4：一代測(cè)序驗(yàn)證單克隆
本研究通過(guò)菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證了Echo 525涂布系統(tǒng)的單克隆可靠性：
在18個(gè)隨機(jī)挑選的克隆中，94.4%（17/18）呈現(xiàn)單一目的條帶和純凈測(cè)序峰圖，證實(shí)該系統(tǒng)產(chǎn)生的菌落均為單克隆?；诖?，我們建議優(yōu)化工作流程：
直接使用收菌后濃縮10倍的菌液進(jìn)行Echo涂布，可提升操作效率；
根據(jù)實(shí)際轉(zhuǎn)化效率，可適當(dāng)減少單樣本轉(zhuǎn)移液滴數(shù)量（當(dāng)前48滴/樣本）。該方案質(zhì)粒構(gòu)建成功率顯著高于常規(guī)方法。
結(jié)論
Echo 525適配高通量菌株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)體系，解決平板涂布耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、耗材使用量大等問(wèn)題，以構(gòu)建96個(gè)重組質(zhì)粒的平板涂布為例：
一. 效率提升：
*按照每個(gè)樣本轉(zhuǎn)移12個(gè)菌液液滴計(jì)算
二. 成本優(yōu)化
耗材節(jié)省
平板用量：Echo525僅需3塊SBS標(biāo)準(zhǔn)板（vs手工96塊板/QPix 12塊8格板）
- 較手工降低97%（96板→3板）
- 較QPix降低75%（12板→3板）
輔助耗材：零吸頭消耗（傳統(tǒng)方法需96個(gè)無(wú)菌吸頭）
硬件需求節(jié)省
與手工涂布或QPix 460涂布相比，Echo高通量平板涂布所需的溫控培養(yǎng)箱數(shù)量減少97%或75%，大大降低了溫控培養(yǎng)箱的硬件成本。
