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【Vi-CELL視野】Vi-CELL XR細(xì)胞識別參數(shù)新建和優(yōu)化操作指南
Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的分析軟件中自帶六種細(xì)胞類型（Cell Type），分別是CHO、Hybridoma、SF-9、SF-21、Vero和Yeast（如下圖所示）。
如果我們使用Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)儀時(shí)，需要檢測一種新的細(xì)胞，該如何創(chuàng)建合適的Cell Type參數(shù)呢？針對這個問題，我們編寫了這個Cell Type識別參數(shù)新建和優(yōu)化的操作指南。
從分析軟件界面File→Cell Types→Add進(jìn)入Cell Type新建界面（如下所示），譬如Cell Type命名為“Demo Cell Type"。
注意：
若是Vi-CELL XR測試過的舊項(xiàng)目或轉(zhuǎn)移項(xiàng)目，按以前使用的Cell Type參數(shù)直接在General和Image Analysis窗口輸入相應(yīng)的數(shù)值即可。
若是新的項(xiàng)目使用Vi-CELL XR未檢測過的細(xì)胞，則可以從軟件已有的六種細(xì)胞類型（Cell Type）中挑選一個大小、形態(tài)和團(tuán)聚都接近待測細(xì)胞的Cell Type來參考設(shè)置識別參數(shù)。
務(wù)必在輸入樣品檢測信息“Log in sample"界面中選上“Save Images"（如下照片中紅色箭頭所示）。
若發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果Total下面的活細(xì)胞密度“Viable cells/ml"、活率“Viability"和平均直徑“Avg. diam (microns) "不正常，或者檢查拍攝的細(xì)胞照片中有不少未識別到的細(xì)胞，或者照片中有死/活細(xì)胞的錯誤識別，此時(shí)就需要對Cell Type的識別參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。
第一步：
檢查測試完的50張細(xì)胞照片中有無沒被軟件識別標(biāo)記的細(xì)胞（死細(xì)胞標(biāo)記為紅色、活細(xì)胞標(biāo)記為綠色），若有較小或較大的細(xì)胞未被識別，通過設(shè)置合適的Minimum Diameter和Maximum Diameter，將未識別到的小細(xì)胞和大細(xì)胞標(biāo)記為死/活細(xì)胞。可以設(shè)定所需細(xì)胞的直徑范圍，若照片中有顆粒超出該范圍，則被認(rèn)為不是細(xì)胞。
第二步：
通過Minimum Diameter和Maximum Diameter調(diào)整后還有未識別的細(xì)胞，此時(shí)就需要對細(xì)胞識別參數(shù)Cell Brightness、Cell Sharpness、Minimum circularity和Decluster degree進(jìn)行優(yōu)化。具體操作如下所示：
Cell brightness（細(xì)胞亮度）：指細(xì)胞邊界亮度，用于區(qū)分細(xì)胞像素和背景像素，一般默認(rèn)設(shè)置為85。
Cell Sharpness（細(xì)胞清晰度）：考察細(xì)胞邊緣厚度和模糊程度的參數(shù)，一般默認(rèn)設(shè)置為100。
Minimum circularity（最小圓度）：用于限定細(xì)胞的圓度下限，從而消除細(xì)胞碎片的影響，該參數(shù)只影響標(biāo)記的死細(xì)胞。當(dāng)設(shè)置1時(shí)，要求細(xì)胞是的圓，一般默認(rèn)設(shè)置是0.5。
Decluster degree（去團(tuán)聚度）：根據(jù)團(tuán)聚細(xì)胞中的平均細(xì)胞數(shù)量來選擇團(tuán)聚度，若沒有團(tuán)聚可以選擇None；若存在少量明顯的細(xì)胞團(tuán)聚，譬如2-3個細(xì)胞的團(tuán)聚選擇Low；照片中出現(xiàn)許多團(tuán)聚細(xì)胞時(shí)選擇Medium，針對酵母細(xì)胞選擇High。
團(tuán)聚度級別從None到High以此逐級提高，默認(rèn)是Medium。None（無）→Low（低）→Medium（中）→High（高），設(shè)置越靠后，統(tǒng)計(jì)分析得到的細(xì)胞數(shù)越多。
第三步：
死/活細(xì)胞標(biāo)記錯誤時(shí)，需要對參數(shù)Viable Spot Brightness或Viable Spot Area優(yōu)化。
Viable Spot Brightness（活細(xì)胞斑點(diǎn)亮度）：是查看細(xì)胞中心的亮度，以確定細(xì)胞是活細(xì)胞還是死細(xì)胞，細(xì)胞中心越亮越白，會判定為活細(xì)胞，反之則為死細(xì)胞。細(xì)胞中心亮度高于該數(shù)值的被記為活細(xì)胞，反之是死細(xì)胞。該數(shù)值常見設(shè)置范圍是70-90。
Viable spot area（活細(xì)胞斑點(diǎn)面積）：該參數(shù)是活細(xì)胞亮斑面積占細(xì)胞總面積的百分比，超過該數(shù)值的細(xì)胞被識別為活細(xì)胞。
對于低濃度細(xì)胞樣品，拍攝的照片數(shù)量Images改為100張，以提高統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的可靠性。對于剪切力比較敏感的細(xì)胞，建議Aspiration和Trypan blue mixing cycles設(shè)置小一些，可以分別設(shè)為1和2。對于需要更長時(shí)間染色的細(xì)胞，可以將Trypan blue mixing cycles設(shè)置更大一些。
分析結(jié)果達(dá)到預(yù)期時(shí)保存這個優(yōu)化后的Cell Type，然后使用這個新建的Cell Type多檢測幾組細(xì)胞樣品，從而驗(yàn)證這些參數(shù)設(shè)置是合適的。因?yàn)閂i-CELL XR檢測分析的細(xì)胞一般有成千上萬個，所以偶爾有幾個細(xì)胞沒有被識別到，關(guān)系不是很大。
